微量分光光度计原理及应用

微量分光光度计原理及应用

   微量分光光度计能够快速准确的定量检测核酸、蛋白质等溶液。具有使用方便、消耗样品少(仅2μl)、不用预热、能迅速清理残留样品、不需要比色皿或其它样品定位装置、样品不需要稀释等特点，常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量，目前已成为众多实验室的常规仪器。

  工作原理

  超微量分光光度计进行浓度测定的原理是根据朗伯-比尔（Lamber-Beer）定律，

A＝K·C·L

   式中，A为吸光度；K为吸（消）光系数；C为溶液的浓度；L为液层厚度。此公式说明：在入射光一定时，溶液的吸光度与溶液的浓度及液层厚度成正比。此式就是光的吸收定律的数学表达式，又叫朗伯-比尔定律。

  核酸定量

  核酸的定量是超微量分光光度计使用频率最高的功能。可以定量测定溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA以及RNA含量。这是由于核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键，具有紫外吸收的特性，最大的吸收波长在260nm，吸收波谷在230nm。

  除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。

  蛋白质直接定量

  这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。

  比色法蛋白质定量

  蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。

  比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。